BalbRT Q M-MLV反转录酶

产品货号：

YTB3013

中文名称：

BalbRT Q M-MLV反转录酶

英文名称：

BalbRT Q M-MLV reverse transcriptase

产品规格：

10kU|50kU|200kU

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本制品是一种经过改造和优化特别适合定量PCR(qPCR)的高精确度反转录酶。BalbRT Q M-MLV反转录酶具有正常的依赖于RNA或DNA模板的DNA聚合酶活性，能够以RNA或DNA为模板，在引物存在的情况下进行互补DNA链的合成，即可以进行cDNA的第一链合成。同时本反转录酶还保留了RNase H活性，能选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA，有利于后续cDNA第二链的合成。

本制品是最常用的优质反转录酶之一，广泛用于获得总RNA或mRNA后cDNA第一条链的合成，特别适合用于qPCR和一步法的qRT-PCR，本制品的反转录产物也适合用于常规的PCR、cDNA的第二链合成以及cDNA文库的构建，以及逆转录所得目的基因的克隆等。BalbRT Q M-MLV反转录酶还可以通过反转录用于DNA探针的荧光、生物素、地高辛或同位素标记等，也可以通过引物延伸来分析和研究RNA。

本制品反转录性能优、检测灵敏度高、扩增特异性强、反应稳定性好，不仅非常适合用于常规的RNA样品的反转录和qPCR检测或一步法qRT-PCR检测，也非常适合于內源低丰度RNA、外源病毒RNA等微量RNA的反转录及后续的qPCR检测。

大肠杆菌表达纯化的经过优化改造的M-MLV反转录酶。

酶活定义

一个活性单位是指以poly(A)·oligo(dT)_12～18为模板引物，37℃条件下，10min内将1nmol的dTTP掺入酸性不溶物所需的酶量。
反应缓冲液：50mM Tris-HCl(pH8.3)，75mM KCl，3mM MgCl₂，10mM DTT，0.5mM [³H]-dTTP，0.4mM polyA·oligo(dT)_12～18。

产品组成

组分	10kU	50kU	200kU
BalbRT Q M-MLV反转录酶(200U/μL)	50μL	250μL	1mL
5×Reaction Buffer	300μL	1.2mL	5mL

保存：-20℃

20mM Tris-HCl(pH7.5),150mM NaCl,0.1mM EDTA,1mM DTT,0.01%(v/v) NP-40 and 50%(v/v) glycerol。

质量控制

不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶，可以满足常规反转录合成cDNA第一条链等的需要。

失活抑制

80℃孵育10分钟可以导致BalbRT Q M-MLV反转录酶失活；
EDTA、EGTA等螯合剂、无机磷酸盐或焦磷酸盐以及聚氨(polyamine)对BalbRT Q M-MLV反转录酶有抑制作用。

对于GC含量比较高的RNA的反转录，产品的使用说明中给予了特别说明，请予以关注。
本制品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

利用BalbRT Q M-MLV反转录酶对总RNA进行反转录，之后以不同稀释倍数的cDNA为模板，通过qPCR检测目的基因的结果请参考图1。

图1.BalbRT Q M-MLV反转录酶对总RNA进行反转录后用于qPCR检测的效果图。从HEK293T细胞抽提获得的总RNA 2μg，在20μL反转录体系(2μg Total RNA,0.5μg Oligo(dT)18 primer,0.2μg Random Hexamer primer,1×Reaction Buffer,20U RNase Inhibitor,dNTP Mix (1mM each),200U BalbRT Q M-MLV反转录酶)中进行反转录，反转录后取1μL (100%)或不同稀释比例(1μL的10%、1%、0.1%、0.01%)反转录产物进行GAPDH cDNA 151bp目的片段的qPCR扩增和电泳检测。A.扩增曲线图。B.溶解曲线图。C.qPCR扩增产物的电泳图。NTC (no-template control)，用水代替反转录产物。qPCR反应体系20μL，使用荧光定量PCR反应预混液(SYBR Green I)。实际检测效果会和特定实验条件有关，图中结果仅供参考。

使用方法

cDNA第一条链的合成：

参考如下表格中设置的20μL反转录体系(RNase抑制剂和25mM dNTP混合液可从百奥莱博订购)：

成分		用量
模板(右侧3种任选其中一种)	Total RNA	0.1ng～5μg
	或poly(A) RNA/mRNA	10pg～0.5μg
	或specific RNA	0.01pg～0.5μg
引物(右侧3种任选其中一种)	Oligo(dT)₁₈ primer	0.5μg(或100pmol)
	或Random Hexamer primer	0.2μg(或100pmol)
	或gene-specific primer	15-25pmol
DEPC-treated Water		至13.7μL
选择性步骤：如果模板RNA的GC含量较高(例如大于55%)或者有比较严重的二级结构，混匀后微离心以把液体沉降至管底，65℃孵育5min，随后立即置于冰上冷却，以打开RNA中一些比较稳定的二级结构。
5×Reaction Buffer		4μL
RNase Inhibitor(40U/μL)		0.5μL
dNTP Mix(25mM each)		0.8μL
BalbRT QM-MLV反转录酶		1μL
总体积		20μL

轻轻混匀(用移液器轻轻吹打混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
如果使用Oligo(dT)₁₈或基因特异性引物，42℃孵育10～60min。如果使用random hexamer(随机六聚体)作为引物，先在25℃孵育10min，随后在42℃孵育10～60min。反转录3kb以下的cDNA，反转录10min即可，反转录3～6kb的cDNA，反转录30min即可，而6kb以上的cDNA推荐反转录60min。当使用random hexamer(随机六聚体)作为引物，并且后续用于qPCR时，后续检测任何长度的基因，均反转录10min就足够了。
80℃孵育10min以失活BalbRT Q M-MLV反转录酶并终止反转录反应。
- 对于5kb以上的长片断cDNA不推荐采用加热的方法失活反转录酶，该方法易导致部分长片断DNA被剪切，此时可考虑酚氯仿抽提或柱纯化方法。
反转录产物可以直接用于后续的PCR反应等，也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时，如果PCR的反应体系为20μL和50μL，则推荐相应地使用0.8μL和2μL反转录产物。

qPCR检测：
- 推荐使用荧光定量PCR反应预混液(SYBR Green I)进行常规的荧光染料法qPCR检测，或者使用探针法qPCR MasterMix进行Taqman探针法qPCR检测。
- qPCR的具体条件，请参考qPCR试剂盒的相关说明。
引物延伸、探针标记等其它用途请自行参考M-MLV反转录酶的相关文献资料进行。

总RNA反转录产物电泳观察不到。
- 反转录产物由于是从模板反转录而获得，而模板的量本身比较低，反转录的量通常还要少于模板量，并且总RNA的反转录产物大小很不均匀，因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。
反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
- PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠佳，当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。
- 模板RNA发生了降解。哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带，并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0。如果比例小于2.0，则提示总RNA发生了显著的降解，最好能重新制备总RNA样品。避免RNA降解的主要方法是，严格进行RNA的相关操作，包括带洁净手套、戴一次性口罩、在洁净环境中抽提或制备RNA，以尽量避免RNase污染。
- 模板RNA的纯度偏低。在提取纯化RNA的过程中，残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA、胍盐、磷酸、焦磷酸、多胺、亚精胺等会抑制反转录酶活性。对RNA样品进行柱纯化，或者进行沉淀、洗涤和再溶解，通常可以有效去除残留的污染物。通常选择使用百奥莱博的BalbZol或Trizol抽提获得的总RNA完全可以满足反转录反应的需要。
- 反转录反应的模板量不足。在抽提获得总RNA后，在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化，以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时，需要加入EDTA至终浓度为2.5mM，否则RNA在没有螯合剂的情况下，在加热过程中容易被水解，从而导致模板量不足。此外，扩增特定基因时，需要先查询该基因的组织分布特点，利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。用该基因丰度极低的组织或细胞样品进行反转录和PCR扩增，通常会由于模板量过少而PCR扩增失败。
- 没有使用适当的反转录引物。对于细菌RNA和不含poly(A)尾巴的RNA，要用random hexamer引物代替Oligo(dT)18引物。使用基因特异性反转录引物时，需要确保基因特异性引物设计合理正确。

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